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发表于 2009-10-20 15:02:14
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来自: 中国北京
万珂 Velcade用于治疗复发性和难治性多发性骨髓瘤(试验于NSCLC)
千年制药公司 (Millennium Pharmaceuticals, Inc,)与其合作开发合伙人强生制药研发公司(Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development,简称“J&JPRD”)针对此前化疗无效的局部晚期或转移性非小型细胞肺癌 (NSCLC) 的患者联合启动一个由三部分组成的随机的 VELCADE 和培美曲唑 (pemetrexed) 的二期研究。
该研究将评估将两种具有不同作用机理的目标疗法的活性结合起来的潜在附加好处。针对局部晚期或转移性 NSCLC 的患者的结合 VELCADE 和埃罗替尼 (erlotinib) 的二期研究也正在进行中,另一个正在进行的研究是单药剂 VELCADE 用于复发的细支气管肺泡癌和肺腺癌。在新近被诊断出患有 NSCLC 的患者中,评估与其它药剂结合的 VELCADE 的研究刚刚结束。
临床开发 (Clinical Development) 高级副总裁 David Schenkein 医学博士表示:“以有希望的单药反应率为基础,我们将继续我们的临床计划,以便评估基于 VELCADE 的疗法在治疗 NSCLC 中的疗效。我们希望表明这些方案可带来更多的功效且更安全,并对这些疾病晚期的患者有所帮助。”
随机、开放标签和多中心的二期研究将招募约135名患者。根据实体肿瘤治疗反应评价标准 (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,RECIST) 的标准评定,该研究的主要终点是客观反应率(完全和部分的反应)。该研究的次要终点包括疾病控制率(完全反应、
部分反应和稳定疾病)、进展所用时间、无进展生存时间和安全性。患者将被分配至下面三个治疗组中的一组:VELCADE 与培美曲唑结合、单用培美曲唑或单用 VELCADE。在研究的两个部分中 VELCADE 将按周用药。该研究中 VELCADE 的周剂量为 1.6 mg/m2,而培美曲唑将按 500 mg/m2 的标准登记剂量来用药。
velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用
研究结果表明,velcade可以抑制U266细胞的生长,同时伴有细胞活率的降低。U266细胞经2、10、50和100 nmol/L浓度velcade 24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为18.7%、45.45%、59.86%和68.9%,48小时时分别为34.45%、61.46%、73.75%和82.04%;在0、2、10、50和100 nmol/L浓度时24小时活率分别为97.31%、91.38%、79.91%、61.48%和42.62%,48小时时分别为96.57%、76.60%、58.41%、30.40%和14.05%。根据活率48小时时下降70%-80%选择药物浓度,因此选择velcade 50 nmol/L作为药物处理浓度(图1)。
velcade对U266细胞凋亡作用
50 nmol/L velcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变,表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等(图2A)。24小时Annexin V-FITC/PI 双标结果显示,凋亡细胞比例重复3次的均值为61.3%,明显高于未用velcade处理对照组的3.56%(图2B)。线粒体跨膜电位(△ψM)检测显示△ψM降低,Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为56.3%,对照为95.02%(图2C)。
活性氧检测
我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。结果发现,在12小时时活性氧明显增高,平均荧光强度显著增高,由对照的1.95增强到10.8,流式细胞仪直方图右移(图3)。
bcl-2检测
采用RT-PCR检测内源性细胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。结果显示,U266细胞经50 nmol/L velcade处理后,随着作用时间的延长,其表达逐渐降低(图4)。
讨 论
泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UP通路)是由泛素化系统和蛋白酶体组成,在调节细胞周期和肿瘤生长中有着重要的作用,该通路参与细胞内绝大多数的蛋白降解,如许多重要的涉及细胞信号转导、转录调控和细胞周期的调节蛋白。蛋白酶体存在于所有的真核细胞中,蛋白酶体抑制剂可以通过干涉这些重要蛋白的降解,触发肿瘤细胞周期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡而使肿瘤进展延缓或静止[3-7]。
Velcade 是一种硼酸二肽化合物,是高选择性、可逆性的26S蛋白酶体抑制剂,首先在美国国家肿瘤协会的一组60种肿瘤细胞系中表现出抗肿瘤作用。velcade对MM细胞的作用表现在诱导细胞凋亡、抑制生长、抑制细胞黏附和骨髓血管生成等多个方面。本研究显示,其对U266细胞具有增殖抑制作用,并随着时间的延长和剂量的增加呈现增殖抑制加强,活率降低趋势。
诱导细胞凋亡有3种信号通路:FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路,目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用。细胞凋亡过程中,细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏,发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)由内层向外层的翻转,暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬,从而使凋亡细胞得以被清除。
Annexin V 为一种磷脂结合蛋白,可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸,所以经常被用于检测细胞凋亡[8]。Rh123 是一种亲脂性阳离子,可发射绿色荧光,它可被线粒体吸收,并且其吸收量与线粒体△ψm成正比[9]。正常的活细胞因为线粒体△ψm高,所以其摄入的Rh123 也高,因此细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体△ψm会降低,细胞表现为Rh123 低染。本研究结果显示,Velcade处理U266细胞24小时时凋亡细胞明显增高,△ψm明显降低,这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的,Velcade还可通过线粒体信号通路,即内源性凋亡途径诱导U266细胞凋亡。
ROS 是细胞有氧呼吸过程中产生的一些小分子物质,主要包括O-2 、OH-及其活性衍生物如H2O2 、HOCl 、O2等。这些物质具有较高的反应活性,易与细胞内的大分子物质反应,导致细胞结构的广泛损伤,如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤等。近年的研究认为,活性氧是细胞凋亡的信号之一,ROS的产生可直接或间接改变线粒体膜电位,促进Cyt C从线粒体内释放,启动线粒体信号通路,诱导细胞凋亡[10]。线粒体是ROS产生的主要场所,内质网(ER)中同样会有ROS的生成。Fribley 等报道[11]蛋白酶体抑制剂velcade通过同时诱导ER应激(stress)和ROS生成引起人头颈癌细胞凋亡,ROS的抑制剂Tiron能够显著抑制凋亡,caspase-9和caspase-3的活化,并且能够阻碍ER应激相关蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表达。这些结果提示,ROS在ER 应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。用DCFHDA 作为荧光探针测定细胞内ROS 水平时,发现velcade在24小时时能明显增高U266细胞内活性氧水平,这说明velcade可改变多发性骨髓瘤细胞内氧化还原状态,导致线粒体和内质网产生ROS增多,从而诱导U266细胞凋亡。由此我们推测,不仅线粒体途径参与了velcade诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡,而且ER应激途径也可能通过ROS的产生而发挥诱导凋亡作用。
bcl-2基因是抗细胞凋亡的关键基因,其表达的增高与多种肿瘤有着密切关系,并且可导致肿瘤细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡,使肿瘤细胞对各种化疗药物耐受,导致缓解率低[12]。bcl-2表达降低在内源性细胞凋亡即线粒体信号通路中起关键作用,很多化疗药物可通过抑制bcl-2基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究通过半定量RT-PCR的方法检测了bcl-2 mRNA的表达,结果显示其表达水平降低,并随着velcade药物作用时间的延长而表达量逐渐减少,这一结果从分子水平进一步证实了velcade的诱导细胞凋亡作用及其作用机制主要是通过线粒体信号通路。 |
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