ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素联合治疗克服非小细胞肺癌ＥＧＦＲ-ＴＫＩ获得性耐药

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  ２ 证据水平    １ｂ。
    ３ 背 景
    可逆的酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼延长了非小细胞肺癌患者的生存时间，但耐药的发生常常影响治疗效果。
    研究显示，５０％的耐药是由于表皮生长因子受体激酶区发生Ｔ７９０Ｍ二次突变。不可逆的ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２双重抑制剂ＨＫＩ-２７２可以有效地抑制Ｔ７９０Ｍ突变。
    研究表明，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ通路在肿瘤的发生和发展过程中占据着中枢性的位置，而雷帕霉素可以解除依赖于ｍＴＯＲ-Ｓ６的胰岛素生长因子受体底物（ＩＲＳ-１） 和ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号的反馈抑制作用，并且抑制ｍＴＯＲ-Ｓ６介导的其他生长因子受体。
    单独应用ＨＫＩ-２７２或者雷帕霉素不能取得理想疗效，而两者联合应用却产生引人注目的肿瘤消退的结果。
    ４ 目 的
    研究联合应用ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素对非小细胞肺癌的治疗作用。
    研究性质：临床前研究。
    研究对象、干预措施见图１。
    评价指标：主要终点指标为肿瘤体积大小（ＭＲＩ），细胞信号分子。次要终点指标为细胞存活。
    ６ 主要结果
    ＥＧＦＲ-ＴＬ ｍＲＮＡ可调性表达。
    Ｄｏｘ（多西环素）诱导前８ ｗ、诱导后８ ｗ、撤药后３天及１２ ｗ ＥＧＦＲ-ＴＬ ｍＲＮＡ定量情况见表１。
    ＥＧＦＲ-ＴＬ突变过表达产生两种不同的肺肿瘤：
    Ｄｏｘ诱导后４～５ ｗ表现为细支气管肺泡细胞癌）；
    Ｄｏｘ诱导后７～９ ｗ表现为侵袭性周围型腺癌，１２ ｗ后成为主要类型。
    ＥＧＦＲ-ＴＬ突变从根本上维持着两种肿瘤的发生发展。
    两种类型肿瘤磷酸化ＥＧＦＲ抗体染色阳性，表明ＥＧＦＲ突变功能激活，而在撤药后３天，抗体染色转为阴性，表明两种肿瘤依赖于ＥＧＦＲ突变。
    两种肿瘤对埃罗替尼耐药，但是对ＨＫＩ-２７２敏感，各组肿瘤体积情况见表２。
    ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素联合对肿瘤组织更加敏感，见表３。
    体内体外试验表明ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素协同抑制ＥＧＦＲ ＴＬ-ＰＩ３Ｋ-ｍＴＯＲ轴，见表４。
    协同作用对胞内突变信号分子更敏感，见表５。
    ７ 结 论
    不可逆的ＥＧＦＲ抑制剂ＨＫＩ-２７２和ｍＴＯＲ抑制剂雷帕霉素协同使用，对后天获得埃罗替尼耐药的非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者产生敏感的反应。
    ８ 评 论
    肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为世界癌症死亡的首要原因。非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）是最常见的肺癌类型，占所有肺癌总数的８０％以上。大部分ＮＳＣＬＣ 患者在就诊时已经属于晚期或局部晚期，失去了手术机会。其中，相当多的患者属于对传统化疗无效的难治性肺癌，尚无好的治疗方法。近年来，新型靶向治疗药物在临床实践中取得了显著疗效，吉非替尼和埃罗替尼便是非小细胞肺癌靶向治疗的代表性药物。
    吉非替尼和埃罗替尼属于小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶（ＥＧＦＲ-ＴＫ）抑制剂，其通过竞争性与ＥＧＦＲ-ＴＫ催化区域的Ｍｇ-ＡＴＰ位点结合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻断表皮生长因子受体的信号传导通路。它们与ＡＴＰ位点的结合是非共价键结合，属于可逆性ＴＫＩ［１］。这两种药物对大约１０％～２０％的难治性肺癌显示出神奇的疗效，掀起了肺癌分子靶向治疗的高潮［２］。
    自从２００４年３篇文章报道ＥＧＦＲ突变可以预测吉非替尼和埃罗替尼对非小细胞肺癌的临床疗效以来，越来越多的证据表明吉非替尼和埃罗替尼属于选择性的ＥＧＦＲ-ＴＫＩ。它们主要对于发生了ＥＧＦＲ １９外显子缺失突变和２１外显子Ｌ８５８Ｒ点突变的患者有效，这两种突变为敏感突变。大约１０％的美国患者和３０％的亚洲患者拥有这种突变，因此，这两种药对亚洲人更有效。
    ２００５年的１篇报道使人们对于这两种药物的疗效认识逐渐回归理性：通过ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ位点的二次突变，患者可以产生对吉非替尼和埃罗替尼的耐药性，并且在治疗６～９个月后就会发生这种突变。一半患者的耐药性是由于Ｔ７９０Ｍ位点的二次突变引起的。因此，对于含有敏感突变和Ｔ７９０Ｍ双突变的ＥＧＦＲ有拮抗作用的药物，很有可能就是能够治疗耐药患者的有效药物。
    人们首先想到的就是新型ＥＧＦＲ ＴＫＩ——不可逆性抑制剂，以ＨＫＩ-２７２为代表。这类药物与ＥＧＦＲ发生共价键结合，形成不可逆的复合物，从而产生更强的抑制作用。体外研究表明ＨＫＩ-２７２对于含有双突变的肺癌细胞系有效，但是不能完全阻断Ｔ７９０Ｍ突变的信号传导，对于该药需要更多的临床前研究，以深入阐明该药的药物机制。
    含有ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ和Ｔ７９０Ｍ双突变（ＥＧＦＲ ＴＬ）的双转基因工程小鼠为深入研究提供了强有力的工具，成为此篇文献的研究亮点。双转基因工程小鼠是近年来发展起来的新一代基因工程小鼠，它利用反式四环素调控系统（ｔｅｔ-ｏｎ）调控基因在肺泡及支气管上皮进行特异性的时空表达。其首先建立以小鼠Ｃｌａｒａ 细胞分泌蛋白启动子为启动子，含反式四环素调控激活因子基因的基因工程鼠。由于以ＣＣＳＰ为启动子，该基因工程鼠只能在肺泡及支气管上皮表达ｒｔＴＡ。接着再构建含有７个线性重复的四环素操纵子紧跟双突变ＥＧＦＲ的ｃＤＮＡ及ｂ－球蛋白ｐｏｌｙＡ的真核表达载体，建立基因工程鼠。将此两种基因工程鼠杂交，产生Ｔｅｔ-ｏｐ-ＥＧＦＲ ＴＬ／ＣＣＳＰ-ｒｔＴＡ双转基因鼠。在强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）存在的情况下， ｒｔＴＡ与Ｔｅｔ-ｏｐ结合，引起ＥＧＦＲ ＴＬ转录与表达。由于ｒｔＴＡ只能在肺泡及支气管上皮中表达，使得ＥＧＦＲ ＴＬ的转录与表达严格限制于肺内（空间特异性）。ｒｔＴＡ只能在强力霉素存在的情况下与Ｔｅｔ-ｏｐ结合，通过饮水或食物控制小鼠体内强力霉素出现的时间，便可以控制ＥＧＦＲ ＴＬ的表达时间（时间特异性）［３］。正是由于实验的巧妙构思和合理设计，实现了ＥＧＦＲ ＴＬ的时空特异性表达，获得了可靠的结果，产生了令人信服的结论。
    该模型研究结果表明：
    （１） ＥＧＦＲ ＴＬ是一个癌基因，在强力霉素的刺激下，可以形成肺腺癌；停止强力霉素的刺激，可以使肿瘤消失，表明ＥＧＦＲ ＴＬ对于维持肿瘤生长异常重要。
    （２） ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ突变及缺失型突变仅仅引起肺泡上皮癌变，产生支气管肺泡癌或混合性肺腺癌（支气管肺泡癌为主型）。与此不同，ＥＧＦＲ ＴＬ突变除形成支气管肺泡癌外，还可以产生起源于支气管上皮的肺中央型乳头状腺癌。
    （３）单独使用埃罗替尼或雷帕霉素治疗ＥＧＦＲ ＴＬ形成的肿瘤无效；单独使用ＨＫＩ-２７２仅仅使外周型的支气管肺泡癌消失，而对中央型乳头状腺癌无效。联合应用埃罗替尼和雷帕霉素对ＥＧＦＲ ＴＬ形成的肿瘤无效。而ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素联合使用对ＥＧＦＲ ＴＬ形成的肿瘤疗效显著。
    （４）ＨＫＩ-２７２和雷帕霉素单独应用均不能使ＥＧＦＲ ＴＬ信号传导通路完全受到抑制，两者联合应用通过完全抑制ＥＧＦＲ ＴＬ-ＰＩ３Ｋ-ｍＴＯＲ信号传导通路，使ＥＧＦＲ ＴＬ形成的肿瘤完全消失。
    通过上述结果可以推测出ＥＧＦＲ ＴＬ双突变与ＡＴＰ的亲和力非常高，无论可逆性或非可逆性的ＥＧＦＲ ＴＫＩ均不能完全抑制ＥＧＦＲ ＴＬ-ＰＩ３Ｋ-ｍＴＯＲ信号传导通路。这也暗示着以前推测的Ｔ７９０Ｍ突变主要通过蛋白质构型改变阻止ＥＧＦＲ与ＴＫＩ结合的假设是错误的，２００８年的报道也证实了这种暗示［４］。
    ＨＫＩ-２７２的Ⅰ期临床研究结果也证实了应用ＥＧＦＲ ＴＬ双突变基因工程小鼠的研究结果。在１２例以前应用吉非替尼和埃罗替尼进展的患者，应用ＨＫＩ-２７２治疗，只有５例患者治疗结果稳定，没有１例部分缓解，表明ＨＫＩ-２７２仅能部分抑制ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突变体的功能。
    该研究也存在部分不够完善的地方：首先，在进行ＨＫＩ-２７２疗效评价的时候，除了应用ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ 基因工程小鼠及ＥＧＦＲ ＴＬ基因工程小鼠外，还应当应用ＥＧＦＲ Ｔ７９ＯＭ基因工程小鼠作为对照组，三组比较得出的结论更有说服力。其次，人类肿瘤是多基因改变的疾病，除了癌基因的活化，还有抑癌基因的失活等等。双转基因工程小鼠仅仅引入了一种基因的变化，远较实际情况简单。目前，基因工程小鼠已经发展到“条件性基因工程小鼠”，可以同时引入两个以上基因的变化，应用此模型的研究结果，将更加接近临床实际。最后，更重要的是，任何动物模型的研究结果，都必须通过必要的临床试验进行验证。

[ 本帖最后由 the 于 2009-5-10 15:51 编辑 ]