HE染色与免疫组化染色有什么区别？

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一、临床现状

临床上，组织病变一旦被诊断为恶性肿瘤，就需要采用传统的手术治疗、放化疗，或者是创新的靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗（细胞治疗暂没有批准到临床）；分子靶向治疗在国内广泛应用于各种肿瘤，尤其是在复发转移患者中，几乎成为肿瘤治疗的终极方案。

近十几年来，随着越来越多的肿瘤药物相关基因和蛋白的发现，我们可以通过分子检测及免疫组化的方法来检测相关基因和蛋白的表达水平，去初步判断患者适用的化疗和靶向药的范围，为下一步更精确的治疗提供依据。


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二、HE染色与免疫组化染色有什么区别

市场上由于各种基因检测技术的灵敏度及特异性差异较大，假阳性与假阴性结果参差不齐，用石蜡切片做肿瘤基因检测之前，一般我们需要做石蜡切片的HE病理检测来评估肿瘤组织的占比；同样肿瘤基因检测中，有的基因需要通过RNA检测或免疫组化病理检测来评估基因的表达量或基因对应编码的蛋白表达量。




那么石蜡切片的HE染色与免疫组化染色有什么区别？

简单来说就是：HE染色就是看大体病理改变，用染料把碱性和酸性物质直接染成蓝色或红色，显微镜下可直接观察组织或细胞的形态；免疫组织化染色就是看目的蛋白的表达情况，用免疫学基本原理（抗原抗体反应），对组织或细胞内抗原或抗体物质进行定性或定量的检测。

&#9654; 三大主要区别

No.1 免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过DAB显色反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。

No.2 HE染色是用苏木素和伊红分别染上胞核和胞浆，可以区分出一般细胞的形态，在实际应用中可以鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等异常病理学改变，在临床上是诊断恶性肿瘤和肿瘤的很好的方法。

No.3 免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位（如active-caspase3和cleaved-caspase3的胞核和胞浆分布状态）、组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。

三、两种染色法详细介绍

1、HE染色法

HE染色全名为苏木精（Hematoxylin）和伊红（Eosin）染色方法，是常规病理染色中最基本的染色技术，作用在于通过它染色后的样本，能够清楚地、细微地辨别正常组织和病理组织的形态结构，对科研和临床都起到了很大的辅助判断作用，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。

苏木精（苏木素）染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。




（1）HE染色原理

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。

组织内构成蛋白质的氨基酸种类很多，它们有不同的等电点，在普通染色法中，染色液的酸碱度pH为6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为“嗜碱性”。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为“嗜酸型”。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性，所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。

● 细胞核染色的原理

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色；脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

● 细胞浆染色的原理

伊红为化学合成酸性染料，在一定条件下可使细胞浆着色；伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比，伊红是细胞浆的良好染料。

● 分化作用

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

● 返蓝作用

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

（2）HE染色评定标准

a.切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；

b.染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

（3）结果的判断

细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

2、免疫组化染色法

免疫组化法全名为免疫组织化学技术方法，应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）。

（1）免疫组化染色法原理

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先把组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法把抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

● 实验所用标本

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织切片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

● 实验所用的抗体

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是把纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

● 常用的染色方法

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

（2）用于免疫组化未染色切片要求

●  固定液应选用10%中性福尔马林固定液，固定时间为24-48小时，固定温度为常温。

●  用于免疫组化的组织切片应捞取在“带正电荷防脱病理载玻片”上，防止脱片。

●  应在58±2℃下，烤片1小时。

●  应提交新鲜切取的切片样本，组织样本在从蜡块制成切片后，样本的抗原性会随着暴露在空气中的时间增加而降低，影响最终检测结果。

切取好的样本，如果长时间不运输检测，应保存在4℃冰箱中。样本运输，考虑时间较短，可采用常温运输。


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