EMT在非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药中的作用及

猫有九条命

目前认为，EGFR突变型NSCLC细胞对EGFR—TKIs获得性耐药的主要相关机
制为EGFR基因的二次突变(20外显子T790M突变)及Met基因的扩增，二者
分别为50％和20％左右，其中约10％重叠，故这两种机制覆盖了约60％
的EGFR-TKI s获得性耐药。但仍有约40％的EGFR突变型NSCLC的获得性耐
药机制以及EGFR野生型NSCLC的获得性耐药机制尚未明确，其中可能包括
EGFR以外的酪氨酸激酶受体(如IGF一1R等)信号传导通路的激活、EGFR下游
信号通路中的分子异常活化、肝细胞生长因子(HGF)过表达、蛋白酪氨酸磷
酸酶基因(PTEN)的缺失、EML4-ALK融合基因及细胞EMT的发生阳性等。

EGFR野生型的NSCLC细胞在EGFR获得性耐药过程中发生了EMT，提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC获得性耐药过程中起重要作用。，是上皮细胞失去上皮特性，获得间质细胞表型的一种生物现象，发生EMT后， 细胞E一钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降
低，波形蛋白、纤维连接素、N一钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。EMT与肿
瘤细胞的原位侵袭和远处转移、药物耐药有密切关系，且与NSCLC的预后
及对EGFR—TKIs敏感性密切相关。
Thomson等n们对EGFR野生型NSCLC细胞的研究显示，表达E—cadherin／beta—catenin的NSCLC细胞对EGFR-TKIs敏感，而表达vimentin／fibronectin的NSCLC细胞则对EGFR—TKIs不敏感。Rho等n33通过建立吉非替尼耐药肺癌细胞亚株(A549／GR)，对比A549细胞株，A549／GR细胞株对吉非替尼的耐药性为A549细胞株的7．7倍；进一步发现，A549／GR细胞表现出EMT表型特点。厄洛替尼耐药的tH,细胞肺癌细胞株H460和Calu6上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达降低，而厄洛替尼敏感细胞株H292的E—
cadherin则呈现高表达¨7，181。吉非替尼耐药的肺癌细胞株H157、H1730、
A549、H520上皮细胞标志蛋白E-cadherin、上皮细胞粘附分子EpCAM、紧密连
接体蛋白claudin4和caludin7的表达普遍较低，而吉非替尼敏感细胞株
H322、H358、H1648这些蛋白表达则增高n9‘21|。Yauch等n印的研究发现，不论在
EGRF野生型还是EGFR突变型的NSCLC细胞，E-cadherin表达均与细胞对
EGFR-TKIs敏感性密切相关。用基因转染增加E-cadherin表达可提高肿瘤细胞
对EGFR-TKIs治疗的敏感性乜2|。
与基础研究结果一致，E-cadherin表达水平可作为预测NSCLC患者对
EGFR-TKIs临床疗效的一个新的生物学标记。一项观察EGFR-TKIs联合化疗治
疗NSCLC的国际多中心随即III期临床研究结果显示：E-cadherin表达阳性的患者疾病进展时间明显延长瞳引。吉非替尼一线治疗NSCLC，E-cadherin表达阳
性的患者总生存显著长于E-cadherin表达阴性的患者瞳引。
多种转录因子密切参与了EMT的发生，目前发现Snail、Slug、Twist、
ZEBl、Smad、NF—B等乜引。研究发现，EMT相关转录因子(ZEBl、slug)在吉
非替尼获得性耐药的过程中也起到关键性的调控作用，靶向消除Slug的表达
能逆转耐药细胞株的间质化特征，恢复耐药细胞株对吉非替尼的敏感性乜6|。对
于NSCLC细胞发生EMT后EGFR-TKIs治疗敏感性下降的分子细胞学机制目前尚
未阐明。有研究显示，EMT可能降低了肿瘤细胞生长或增值对EGFR信号通路的
依赖性，间质表型细胞可产生持续的Akt激活，引发了非EGFR依赖性
P13K／Akt信号通路激活，从而导致了肿瘤细胞对厄洛替尼等EGFR—TKIs治疗的
不敏感妇7|。目前，关于EMT参与NSCLC细胞EGFR—TKIs获得性耐药的具体作用
机制有待进一步深入研究阐明。
拟通过构建靶向CDHl基因的过表达慢病毒表达载体感染EGFR野生型和突变型NSCLC细胞，提高E—cadherin的表达水平，逆转细胞的EMT，观察耐药细胞对EGFR—TKIs的敏感性变化，探讨EMT在NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药中的作用及其可能
的分子学机制，为提高EGFR-TKIs疗效寻找新靶点和新方法。
方法
l、选用EGFR突变型的人肺腺癌细胞PC／9及其吉非替尼耐药细胞
PC9／AB。高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high—resolution
melting，qPCR—HRM)检测PC9／AB细胞EGFR及Kras基因突变；MTT法检测两
组组细胞的增殖情况；划痕实验和Transwell实验检测细胞转移和侵袭能力的
改变； Western blot方法检测两组细胞的EGFR、D-EGFR、E-cadherin、
Viment in、Snai l等的蛋白水平的表达变化。
2、利用GV218质粒构建靶向CDHl(NM-004360)(E-cadherin基因)的
过表达载体和阴性对照载体，并用PCR电泳鉴定和基因测序；经过鉴定测序的构建好的载体质粒转染293T细胞，用Western Blot外源筛选有效过表达载
体；选择转染效果良好的慢病毒载体进行包装并测定滴度；慢病毒感染目的细
胞H460／ER和PC9／AB，并确定转染效率；用实时荧光定量PCR和Western
Blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测对目的基因CDHl的过表达效应。
3、CDHl基因稳定过表达后，观察细胞的形态变化，划痕实验和
Transwell实验检测H460／ER、PC9／AB细胞转移和侵袭能力的改变；Western
Blot检测H460／ER、PC9／AB细胞E-cadherin、Vimentin、Snai l的表达变化。
4 CDHl基因稳定过表达后，MTT法测H460／ER、PC9／AB对的增殖情况变
化，Western blot方法检测EGFR及其磷酸化蛋白的表达变化。
5、统计方法
采用SPSS 13．0软件进统计学分析，结果数据以i±S表示。两组间比较
采用t检验，P<O．05为差异有统计学意义。
结果
1、PC9／AB细胞和H460／ER细胞的EGFR和K-ras基因突变状况
基因突变检测结果显示，PC9／AB细胞为EGFR基因19号外显子缺失突变型
及K-ras基因野生型，无T790M突变及cMET基因扩增。前期研究结果显示，
H460／ER细胞为EGFR基因及K-ras基因野生型。
2、PC9／AB细胞对EGFR-TKIs敏感性下降
MTT法检测结果显示，PC9、PC9／AB细胞均呈无限繁殖。PC9／AB细胞对吉非
替尼的增殖作用显示为浓度依赖性作用，PC9／AB细胞对厄洛替尼的敏感性较
PC9细胞显著下降，IC50值分别为7．23±6．89 u mol／L和0．04±0．00 u mol／L
(P<O．05)。该结果说明，PC9／AB细胞对EGFR-TKIs产生了获得性耐药。
3、PC9／AB细胞的形态学变化
PC9／AB的细胞形态改变与PC9细胞相比，PC一9／AB细胞形态倾向
梭形发展，细胞间连接变得更加疏松，符合间质细胞形态学表现。
4、PC9／AB细胞的迁移及侵袭能力变化
1、PC9／AB细胞和H460／ER细胞的EGFR和K-ras基因突变状况
基因突变检测结果显示，PC9／AB细胞为EGFR基因19号外显子缺失突变型
及K-ras基因野生型，无T790M突变及cMET基因扩增。前期研究结果显示，
H460／ER细胞为EGFR基因及K-ras基因野生型。
2、PC9／AB细胞对EGFR-TKIs敏感性下降
3、PC9／AB细胞的形态学变化
PC9／AB的细胞形态改变与PC9细胞相比，PC一9／AB细胞形态倾向
梭形发展，细胞间连接变得更加疏松，符合间质细胞形态学表现。
4、PC9／AB细胞的迁移及侵袭能力变化
5、PC9／AB的EMT相关分子和EGFR在蛋白表达的变化
western blot结果显示，vimentin、snail的蛋白表达水平均明显增
加，差异均有统计学意义(P<0．05)。EGFR、E-cadherin、13一catenin的蛋
白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0．05)。以上结果表明，PC9细
胞发生获得性耐药后，发生了EMT，且EGFR及其磷酸化蛋白表达降低。

6、CDHl基因慢病毒过表达载体的构建
针对CDHI基因成功构建了2条过表达慢病毒载体LV—CDHI(5386—1)一Pl、
LV—CDHI(5386—1)一P2以及阴性对照载体CONl36；q-PCR法外源筛选出有效过表
达慢病毒载体LV-CDHl(5386-1)并进行病毒包装，获得了较高滴度的慢病毒颗
粒；感染结果显示该慢病毒载体能稳定高效转染H460／ER和PC9／AB细胞。Q—
PCR方法Western blot结果表明LV-CDHI(5386-1)慢病毒对H460／ER细胞的
CDHl基因的mRNA水平提升了约16倍，蛋白表达水平明显升高，LV—
CDHI(5386—1)慢病毒对PC9／AB细胞的CDHl基因的mRNA水平提升了约4倍，
蛋白表达水平明显升高。
7、高表达E-cadherin后的H460／ER和PC9／AB细胞形态变化
与阴性对照细胞相比，PC9／AB-CDHl、H460／ER-CDHl细胞形态倾向椭圆形
发展，细胞间连接变得紧密，符合上皮细胞形态学表现。
8、高表达E-cadherin后细胞的迁移和侵袭能力变化
划痕实验结果显示，与阴性对照细胞相比，PC9／AB—CDHI、H460／ER—CDHI
细胞的划痕两边缘距离均明显增宽。侵袭实验结果显示，阴性对照细胞穿过
Matrigel胶的细胞数明显高于PC9／AB—CDHl、H460／ER—CDHl细胞。以上结果表
明，高表达E-cadherin后，PC一9／AB和H460／ER细胞的细胞侵袭和迁移能力
均明显降低。
9、高表达E—cadherin后细胞EMT相关分子的蛋白水平变化
与阴性对照细胞相比，PC9／AB—CDHI、H460／ER—CDHl细胞的vimentin、
snail的蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义(尸<0．05)；E—
cadherin、B—catenin的蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义(必
0．05)。以上结果表明，高表达E-cadherin后，细胞发生了去EMT的变化。
10、高表达E-cadherin后细胞对EGFR—TKIS的敏感性变化
MTT结果显示，PC9／AB-CDHl、H460／ER-CDHl细胞均呈无限繁殖。吉非替
尼(0．01～10 p mol／L)可抑制PC一9／AB—CDHl细胞生长，该抑制作用呈浓度依
赖性；PC9／AB—CDHI与阴性对照细胞相比，对吉非替尼的敏感性增加约11．4
倍，IC50值分别为(0．70±0．22)u mol／L和(8．68±0．44)u mol／L，差异
有统计学意义(P<0．05)。厄洛替尼(10～100 u mol／L)可抑制H460／ER—
CDHl细胞生长，该抑制作用呈浓度依赖性；H460／ER—CDHl与阴性对照细胞相
比，对厄洛替尼的敏感度增加约6．1倍，IC50值分别为(7．5l±1．12)p
mol／L和(53．72±12．95)u mol／L，差异有统计学意义(P<O．05)。
11、高表达E-cadherin后细胞EGFR基因蛋白水平上的变化
western blot结果显示，EGFR、p-EGFR蛋白表达水平均明显增加，差异
有统计学意义(尸<0．05)。
结论
本研究发现：
NSCLC细胞在产生EGFR—TKIs耐药的过程中出现了EMT。逆转耐药细胞的
EMT可提高NSCLC对EGFR—TKIs的敏感性，上皮间质转化在NSCLC对EGFR—TKIs
的获得性耐药中起重要作用，其机制可能与EGFR磷酸化水平降低有关。