非小细胞肺癌相关基因检测规范建议

奇迹爱学

NSCLC患者接受靶向治疗前进行相关靶基因检测已成为各国指南共识，所以基因检测结果的准确性很重要。在实际检验中，临床标本的采集、处理和保存等对检测的结果往往有决定性的影响，因此，为保证得到高质量的检验结果，必须有一个规范的操作程序。

一、患者的选择，什么样的患者需要做基因检测？

1、晚期NSCLC：包括腺癌、大细胞癌、组织分型不明确的患者及混合组织学类型的鳞癌患者。

2、需术后辅助治疗的Ⅱ期及Ⅲ期NSCLC患者。ADJUVANT及EVAN研究结果显示对于EGFR敏感突变的II~IIIA期给予TKI药物治疗的DFS相比于化疗的DFS均有延长，且安全系数更高。具体数据可参考《早期NSCLC患者术后辅助治疗-靶向治疗》。

注：此时建议对患者的详细信息，如病理诊断、分期、疾病治疗史做记录，以便后续数据分析。


二、标本的选择，哪些标本类型可用于基因检测？

1、FFPE标本（福尔马林固定后石蜡包埋的组）：最常用的标本类型

1.1 病理质控：在FFPE样本进行核酸提取前，要进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例，肿瘤细胞数量至少要200个。

1.2 切片：手术组织样本5μm切5-10张，穿刺活检组织5μm切10-20张，根据病理质控结果，达到所需的200个肿瘤细胞以上，必要时建议对肿瘤细胞进行富集。在切片时有2种方式，一种是切白片放在组织玻片上，一种是切蜡卷放入干净的1.5ml EP管中。

1.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。

注：

1 建议使用3年之内的FFPE标本进行检测，避免核酸严重降解影响检测结果；

2 切片时应注意避免产生交叉污染，每切一个样本需将刀片擦拭干净，清扫切片机时注意避免碎屑飞入装蜡卷的空EP管中；

3 使用二甲苯去除石蜡时，可在56℃加热5min，以便更好的溶解石蜡，避免后续有石蜡残留抑制PCR反应。

2、新鲜组织：可获得高质量的核酸

2.1 标本处理：因为新鲜组织样本中Dnase和Rnase都是活的，会降解核酸，所以核酸提取前样品的保护处理非常重要。新鲜组织切除后（组织量不低于0.2g），需立即放入4-8倍体积的组织保护液中。-70℃以下条件贮存，时间不得长于3年。若无-70℃以下条件，则在-20℃以下条件中贮存，时间不得长于1个月。组织已经置于液氮或-70℃以下环境中保存的，分离前加入10倍体积的组织保护液，置于4℃中解冻。

2.2 标本运输：将新鲜组织放置于组织保护液中，于冰盒中低温运输。

2.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。

3、胸水样本：适用于有胸腔积液的患者

3.1 标本处理：胸水样本采集后要尽快离心（3000rpm离心10min）取沉淀后低温保存，建议将胸水标本制备成细胞蜡块，这样既可以进行病理质控，也便于长期保存。

3.2 病理质控：将包埋所得蜡块切片进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例，确定是否适用于基因突变检测。

3.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。

4、血液样本：取材便捷

血液检测具有无创、匀质，易采集的优点，特别是针对服用TKI药物进展的患者，临床上再次活检比较困难，使血液检测成为临床检测EGFR突变的新选择。

4.1 患者选择：由于血液中含有肿瘤细胞较少，因此进行血液检测应选择IIIB或IV期晚期NSCLC病人，初治病人以检测敏感突变为目的，EGFR-TKI治疗病人以检测T790M为目的，须知化疗和TKI治疗会降低检测阳性率。

4.2 血液采集：采用EDTA抗凝管获得10ml全血，不得使用肝素抗凝管（由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除，肝素也会导致PCR效率降低）。血液采集后立即轻柔颠倒10次，颠倒不充分或颠倒不及时可能发生凝血均导致提取结果欠佳。

4.3 血浆分离：得到的全血应尽快离心分离血浆，建议不超过2小时（禁止冷冻血液标本，建议4℃保存）。两次充分离心（2000g10min, 8000g 10min）后小心吸取转移血浆：



4.4 血浆质量评价

4.4.1 血浆溶血：如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。下图中1/2/3号样本可以检测，4号中度溶血，5号严重溶血，均需重新采血进行检测。



4.4.2 血脂过高：使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰，可建议患者空腹采血。

4.5 血液运输：如需长途运输，建议采用专用常温采血管（可在常温放置7天不影响检测结果）。

4.6 cfDNA提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。

三、基因检测方法的选择，什么样的技术最合适？

进行基因检测选择哪一种检测技术，有一个判定标准，首先：技术灵敏度和特异性：敏感性是指灵敏度，就是指其能测出多少突变丰度。特异性通俗的讲就是准确性，就是结果对不对，测的是不是这个东西。再者：是否得到CFDA认证：基因检测技术必须先形成技术标准、经过严谨的临床验证确定产品质量稳定，检测数据可靠、专家评审通过后才能通过CFDA上市，只有通过CFDA认证的产品才真正算得上是靠谱的。具体参考之前推文《SuperARMS，一种经得起临床验证评估的高灵敏度血液检测技术》。

另外附上目前常用检测技术的对比表。



如果从临床应用来说，由于有法规约束，因此目前ARMs是唯一可以应用于临床上面的技术，并且既可以用于组织检测也可以用于血液检测；ddPCR和SuperARMs（ARMs升级版，针对血液研制，灵敏度0.2%）敏感度较高，主要针对血液检测；而NGS技术对于未知突变和耐药途径的发现是很好的一个手段。实际应用中可根据不同的需求，选择不同的技术即可。

四、肺癌相关基因及检测意义




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早期NSCLC患者术后辅助治疗-靶向治疗

目前对于术后临床分期Ⅱ期和Ⅲ期的NSCLC患者进行术后辅助治疗已成为共识，对此无论是中国还是国外的指南均推荐以铂类为基础的3-4个周期的辅助化疗，但其有效性非常有限，5年生存进提高仅仅在5%左右，且毒性反应大，NP方案（长春瑞滨+顺铂）治疗4个周期，3-4级以上的毒性反应发生率可达60%-70%。

近十年来大量的临床研究和实践已显示表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗EGFR敏感突变晚期NSCLC有良好的疗效及生活质量。所以学者们考虑是否可以将EGFR-TKI延伸至早期NSCLC治疗中，以提高术后辅助治疗效果，减少术后复发及转移。

目前已有多项临床研究聚焦于此，像目标患者定位不准（52%的IB期患者、40%非腺癌患者）且治疗周期不足的但开创了EGFR-TKI辅助治疗先河的NCIC CTG BR19研究；进行初步分子筛选的RADIANT研究，然而选择的是由不确定的预测指标（IB期患者占51%，亚裔人群比例低，仅16.5%的患者EGFR存在EGFR敏感突变）筛选出的伪优势人群接受TKI治疗；以及纳入了TKI获益高度选择的人群，成为首个显示EGFR突变患者可能从辅助厄洛替尼治疗中获益的前瞻性研究的SELECT研究。SELECT研究虽然有争议，但让大众看到术后靶向治疗是可行。

更可喜的是，随着今年6月5日ASCO会场上所吴一龙教授公布的ADJUVANT研究结果以及10月份在WCLC会场上王长利教授公布的EVAN研究结果，术后靶向治疗的迷雾被一层层揭开。


▊ 术后靶向治疗可行性证据一

ADJUVANT（CTONG1104）是由广东省人民医院、广东省肺癌研究所吴一龙教授主持的第一个吉非替尼与辅助化疗用于早期（II~IIIA期)EGFR突变NSCLC的头对头比较疗效和安全性的III期多中心临床试验。实验流程如下：





ADJUVANT研究达到了主要研究终点（DFS）。

研究结果显示：与化疗治疗组相比，接受吉非替尼治疗组患者能够延长DFS期10.7个月（28.7个月对18.0个月），肿瘤复发风险下降40%。3年DFS率也在吉非替尼治疗组得到显著提高（34.0%对27.0%，P=0.013），结果如下图所示：





另外，吉非替尼组相较长春瑞滨联合顺铂组的3级及3级以上的不良事件发生率更低（12.3% vs 48.3%；P< 0.001）。其中，靶向药物的不良反应并不同于化疗，吉非替尼组最严重的不良反应为肝酶升高，而化疗组的不良反应（呕吐、恶心、骨髓抑制、脱发等）则更影响生活质量。

吴一龙教授表示在设计该研究时考虑到了三点：

1、从以往试验中看到淋巴结转移的III期病人获益最大，其次II期的病人，而IB期几乎没有获益。因此临床实验中选择了有淋巴结转移的N1、N2病人。

2、过去的临床实验都是化疗后给予EGFR-TKI，最终得到阴性的结果。因此对于EGFR突变的病人没有拘泥于目前化疗，而是直接EGFR TKI治疗。

3、考虑用药时间。既往所有研究显示II期到III期中位复发时间在9个月到21个月，N2的病人是9到10个月复发，N1的病人到21个月左右。因此要减少复发，时间至少是两年。


▊ 术后靶向治疗可行性证据二

天津市肿瘤医院王长利教授牵头的EVAN研究是一项前瞻性、开放标签、随机多中心Ⅱ期临床研究，旨在比较厄洛替尼对比NP（长春瑞滨/顺铂）方案辅助治疗对IIIA期非小细胞肺癌（NSCLC）完全切除术（R0）后患者的疗效和安全性。实验流程如下：





研究结果显示：ITT（所有随机入组的患者）人群中，厄洛替尼治疗组2年DFS率显著提高：厄洛替尼组为81.35％，NP组为44.62％，P <0.001。3年DFS率继续保持相似的趋势（54.24％ vs 19.83％, P=0.011）。 厄洛替尼组与NP组相比，DFS显著延长，中位DFS分别为42.41个月 vs 20.96个月，HR＝0.268，P <0.001。如下图所示：




说到安全性方面，本研究的安全性特征与既往晚期肺癌的研究观察到的一致，药物相关严重不良事件发生率两组分别为8%和16.3%，安全性可接受。

考虑到以往阴性的研究结果，EVAN的研究设计有几点也是精心考虑的：

第一、入组条件选择非常严格，该研究只纳入了EGFR基因突变的IIIA患者；

第二、纳入的患者必须接受的是R0切除术，采用的是国际肺癌研究协会的切除标准。

▊ 两个研究的对比

纵观两个研究我们可以发现对于EGFR敏感突变的II~IIIA期给予TKI药物治疗的DFS相比于化疗的DFS均有延长，且安全系数更高。

ADJUVANT研究的DFS（28.7mvs18.0m），EVAN研究的DFS(42.41m vs 20.96m)。

笔者认为两者有差别的原因有二（个人观点，仅供参考）：

1、ADJUVANT研究纳入的是II~IIIA期患者，EVAN研究纳入的是IIIA期患者，III期患者术后辅助治疗相对II期患者受益更大；

2、EVAN研究纳入的是严格按照国际肺癌研究协会的切除标准的进行手术切除的R0患者，或许产生的手术切除质量不同而导致不同的生存质量。

▊ 总结

ADJUVANT及EVAN研究结果证实，通过对II-IIIA期术后患者的EGFR基因突变情况进行检测，筛选出可从靶向辅助治疗中获益的人群，使其获得了比化疗治疗更好的疗效，同时治疗面临更少的不良反应。

早期的病人目前没有常规EGFR检测，并且过去公布的ICTAN研究显示早期病人的EGFR突变率在50%到55%之间，跟晚期非常接近。因此，今后或可将疗效已经得到明确证实的EGFR-TKI靶向治疗从晚期肺癌治疗推向对早期肺癌的治疗当中。使得当前肿瘤领域所提倡的“精准医学”概念不仅可以帮助晚期肺癌患者延长生存、提高生活质量，也同样可以成功地运用到分期更早的肺癌患者辅助治疗当中。从而进一步为肺癌患者争取更大的生存获益，为患者带来更为精准、更为有效同时更为安全的治疗策略。