精准检测是精准治疗的前提，非小细胞肺癌罕见靶点突变如何精准检测？

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本文来源：医学界病理频道

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近年来，非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗进展迅速，各种新理念、新手段层出不穷。特别是随着分子检测技术的发展，除了EGFR等常见靶点外，MET、RET、NTRK等罕见或少见靶点也越来越受到关注，检测技术不断完善，针对性靶向药物相继问世，为此类患者的治疗带来了革命性的改变。精准检测是实施精准靶向治疗的前提，对于不同的罕见或少见靶点突变，临床检测有哪些注意事项？本文对此进行了整理。

1、MET14号外显子跳跃突变

在NSCLC中，MET异常的表现形式多样，包括MET14号外显子跳跃突变（以下简称“MET 14跳突”）、MET基因扩增、MET基因点突变、MET基因融合和MET蛋白过表达等。其中MET 14跳突在NSCLC患者中的发生率为0.9%~4.0%。目前已经报道的MET 14跳突主要发生区域包括分支位点（单核苷酸）区域、多嘧啶区域（16个核苷酸）、剪接受体位点（上游2个核苷酸）以及剪接供体位点（下游2个核苷酸）。

在近日发布的《非小细胞肺癌MET临床检测中国专家共识》中，针对MET 14跳突的临床意义、适用人群、检测方法及路径、尚存问题等进行了详尽的阐述，并提出了相关建议和推荐方案。共识指出：

临床意义：MET 14跳突是晚期NSCLC的驱动基因突变之一，是筛选MET抑制剂靶向治疗获益人群的重要分子标志物。

适用人群：晚期NSCLC患者强烈推荐进行MET 14跳突检测。

检测方法：MET 14跳突可使用逆转录即时荧光定量PCR（RT-qPCR）、DNA二代测序（NGS）或RNA NGS进行检测，不同检测方法各有其优缺点，必要时可相互验证或补充检测。MET 14跳突位点形式多样，临床检测和判读中需特别注意。

具体而言，RT-qPCR是以RNA为检测对象，适用于组织及细胞学样本，具有准确率高、平台可及性高、周期短的优点，但由于RNA易降解，因此对样本质量要求高。DNA NGS以DNA为检测对象，目前的试剂盒主要基于扩增子法或杂交捕获法建库，富集MET 14跳突相关区域片段进行基因序列检测。其具有通量高、准确性较高的优点，但检出率会受到引物设计或探针覆盖及生物信息分析能力的影响，且检测周期相对较长。DNA NGS优选肿瘤组织样本或细胞学样本进行检测，当不可及时，也可考虑液体活检样本，但后者可能存在假阴性。与DNA NGS相比，RNA NGS的准确性更高，但其与RT-qPCR一样对样本质量要求高，检测全程需做好质控。

检测路径：晚期NSCLC MET检测首选肿瘤组织/细胞学样本，采用包括MET的多基因联检平台（RT-qPCR或NGS）检测MET 14跳突，DNA NGS检测结果阴性时，可考虑采用RNA样本补充检测。当组织/细胞学样本不可及时，可选择液体活检样本进行MET 14跳突的检测。

值得注意的是，当液体活检出现阴性结果时，应注明假阴性的可能性，必要时建议重取肿瘤组织样本进行复测。

2、RET基因融合检测

RET基因融合在NSCLC中的发生率为1.4%~2.5%，目前已经发现至少50余种RET融合变体，其中KIF5B-RET为最常见的RET融合亚型，约占所有RET融合NSCLC的68.3%。

根据《中国非小细胞肺癌RET基因融合临床检测专家共识》，强烈推荐所有经病理诊断为肺腺癌（包括含腺癌成分的NSCLC）的晚期患者进行RET基因检测；同时推荐经活检组织经病理学证实为非腺癌的晚期NSCLC患者、EGFR-TKI及ALK-TKI耐药患者，以及术后明确为浸润性腺癌的患者进行RET基因检测。

RET基因融合的检测方法主要包括荧光原位杂交（FISH）、RT-PCR和NGS。其中RT-PCR和NGS获得了共识的强烈推荐。共识指出，对于组织、细胞学标本可获取的NSCL患者，依据实验室条件，推荐包含RET在内的多基因DNA NGS检测。对于检出的复杂融合形式或罕见配体，建议通过RNA NGS/RT-PCR进行验证。对于包括RET基因融合在内的驱动基因均阴性时，建议进行RNA-NGS检测。

FISH虽然是检测基因易位/融合的“金标准”，对RET基因融合敏感，但非特异，可能会出现假阳性，而且对非经典RET融合的灵敏度较低。因此，只有在样本量较少或质量不佳时，首选FISH检测；当NGS或RT-PCR不可及时，也可使用FISH进行检测。

对于少数晚期NSCLC患者无法获得组织学或细胞学样本的，共识建议尝试使用液体活检标本（血液、胸腔积液、脑脊液等）进行NGS检测。

3、NTRK基因融合检测

NTRK基因包括NTRK1/2/3三种亚型，可分别产生包含TRKA/B/C激酶结构域的融合癌蛋白。NTRK融合基因在NSCLC中罕见，发生率小于0.1%。

《中国实体瘤NTRK融合基因临床诊疗专家共识》强烈推荐，所有晚期成人实体瘤和儿童实体瘤患者均建议进行NTRK融合基因检测，并且根据不同癌种的特性采取不同的检测策略。NTRK融合基因的主要检测方法包括NGS、ETV6-NTRK3 FISH、RT-PCR和pan-TRK IHC。共识强烈推荐使用覆盖NTRK基因内含子区域的NGS DNA panel或者全外显子组检测作为NTRK融合基因检测的首要手段，NGS RNA panel或者转录组作为NTRK融合基因检测的重要补充手段。此外，共识中指出，pan-TRK IHC可以作为NTRK基因融合发生率较低、NTRK基因不表达且常规条件下不推荐NGS DNA panel方法的癌种初筛方法，也可以作为NGS检测手段的复核手段。

4、ROS1基因检测方法

ROS1重排/融合在NSCLC中发生率为2%~3%。目前共发现十余种ROS1基因融合伴侣。《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）》指出，IHC检测不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”；qRT-PCR用于ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，并且可与ALK联检；NGS检测ROS1基因变异既可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但可能存在假阴性。

需指出的是，在进行FISH、qRT-PCR及NGS检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他技术平台进行检测。当和其他基因（如EGFR、ALK等）一起检测时，可以进行qRT-PCR或NGS检测。

总体而言，对于不同的NSCLC罕见靶点临床检查，目前临床上已经有多种方法可及，但不同检测方法各具有优缺点。在临床实践中，应根据送检标本的类型、数量、质量，所检基因变异类型和数量，以及实验室条件等，为患者选择合适的检测方法，必要时行多平台检测互补和验证。同时在检测过程中应做好质控，确保检测结果的准确性，为临床精准治疗提供指导。