苯丁酸钠(Sodium phenylbutyrate)简介

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Sodium phenylbutyrate is an orphan drug, marketed by Ucyclyd Pharma (Hunt Valley, USA) under the trade name Buphenyl and by Swedish Orphan International (Sweden) as Ammonaps.
苯丁酸钠联合吉非替尼对NB4细胞生物学活性的影响
http://journal.shouxi.net/html/q ... 1932940_282829.html
作者：王旭 李薇 王冠军    作者单位：吉林大学第一医院血液肿瘤科，吉林 长春 130021
【摘要】  目的 探讨联合应用苯丁酸钠(SPB)与吉非替尼对NB4细胞的抑制效果。方法将NB4细胞随机分成4组，即对照组，SPB组、吉非替尼组、和SPB组+吉非替尼组，细胞生长7 d后应用MTT法检测药物对细胞的抑制率，并应用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，应用Western blot 的方法检测p21WAF1、CDK4、野生型p53蛋白的表达，并记录细胞的生长曲线。结果联合用药组肿瘤细胞受到明显抑制，凋亡率增加，p53及p21WAF1表达增加，CDK表达下降。与对照组，SPB组、吉非替尼组相比，差异均有统计学意义（P＜0?05)。结论联合用药效果要比单纯用药效果明显，可以使肿瘤细胞受到明显抑制，凋亡率增加，其机制是通过p53依赖的p21WAF1的激活进而抑制周期素?周期素依赖激酶（cyclinD1?CDK4）复合物，从而阻滞了肿瘤细胞的增殖周期进行的。

【关键词】  苯丁酸钠；吉非替尼；联合用药；NB4细胞1005?

　　The effect of sodium phenylbutyrate combined with gefitinib on the biologic activity of tumor cells

　　WANG Xu, LI?Wei, WANG Guan?Jun?

　　Department of Hematology & Oncology, the First Affiliated Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】Objective   To investigate the inhibitive effect of sodium phenylbutyrate (SPB) combined with gefitinib on NB4 cells.Methods   NB4 cells were randomly divided into control group, SPB group, gefitinib group and combination group. The inhibitive rate was detected by MTT 7 d after cellular growth, the apoptosis of NB4 was detected by flow cytometry, the expression of P21WAF1, CDK4 and p53 were detected by western blot and the growth curve was recorded.Results   The NB4 cells were suppressed obviously, the rate of apoptosis increased, the expression of p53 and P21WAF1 raised and the expression of CDK4 descended in combination group comparing to those in control, SPB and gefitinib group（P＜0.05). Conclusions The curative effect of sodium phenylbutyrate combined with gefitinib is more evident than that of SPB or gefitinib only, the mechanism of which is suppressing cyclinD1?CDK4 complex through activating P21WAF1 depended by p53 to block proliferation cycle of tumor cells.

　　【Key words】 Sodium phenylbutyrate; Gefitinib; Combination medication; NB4 cells

　　从多靶点抑制角度出发进行两药或者多药联合应用抑制使肿瘤细胞生存的信号系统是国际上用药的趋势〔1〕。有研究认为苯丁酸钠(SPB)和吉非替尼均可抑制很多肿瘤细胞的生长，其机制与抑制细胞周期、抑制肿瘤组织周围血管的生长等诸多因素有关。目前国内外尚未见关于SPB和吉非替尼联合应用的文献报道。但从SPB和吉非替尼的作用机制上分析，它们可能在周期抑制上其协同作用，在其他抗肿瘤机制上起互补作用。因此他们，细胞株为本研究室传代保存,悬浮培养于含10%的灭活胎牛血清IMDM培养液中,置于5% CO2、37 ℃培养箱培养,48 h传代1 次,取对数生长期细胞用于实验。碘化丙啶（PI）,Annexin?Ⅴ?FITC由南京凯基生物有限公司提供，应用美国Becton?Dikinson公司生产的FACSalibur流式细胞仪, 兔抗人野生型p53、p21WAF、CDK4一抗及相关二抗，DAB显色试剂盒购自上海康成生物工程有限公司。

　　1?2 SPB和吉非替尼浓度筛选：SPB 分别按照0 mmol/L(空白对照组)、0?1、0?5、1?0、5?0 mmol/L处理,吉非替尼按照0 mmol/L(空白对照组)、5、10、20、30 mmol/L处理，各组细胞接种浓度均为1 ×105 ml-1，连续培养7 d ,每天同一时间台盼蓝拒染法进行细胞计数,MTT法用以观察细胞存活及生长情况,选取对细胞有明显生长抑制,但细胞存活率大于90%的浓度组行下述实验。结果选择SPB 1?0 mmol/L、吉非替尼20 mmol/L联合应用。

　　1?3 SPB和吉非替尼联合应用检测指标                                   
　　按照每个培养瓶中SPB占1?0 mmol/L浓度、吉非替尼占20 mmol/L浓度联合应用。观察细胞生长7 d的状态。实验分组如下：正常细胞对照组；SPB组；吉非替尼组，SPB+吉非替尼组。

　　1?3?1  细胞生长曲线测定                                   
　　将上述4组细胞接种到6孔培养板中,细胞数为2?5×103/孔, 每组3孔，常规培养, 每天倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况, 于接种后2, 3, 4, 5, 6和7 d进行细胞计数, 取均数绘制细胞生长曲线。

　　1?3?2 MTT比色法检测细胞生长抑制率                                   
　　将96孔培养板随机分为空白组、培养基对照组、正常细胞对照组、SPB组、吉非替尼组、和SPB组+吉非替尼组,取培养7 d后的上述细胞按1×104/孔接种。24 h后换液, 48 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h后吸出培养液,每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl,振荡溶解10 min,待结晶完全溶解后,在ELX800酶标仪上选择波长490 nm,空白组调零,测定各孔吸光度A,计算细胞生长抑制率。抑制率=(1-实验组A/对照组A)×100%。每组设15个附孔，重复3次。

　　1?3?3  流式细胞仪检测细胞凋亡                                   
　　取浓度为1?0～1?5×106/ml的细胞悬液0?8 ml加两倍的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗, 然后以14 000 r/min 离心5 min,弃去上清液, 同法再漂洗一遍，加PI 0?4 ml、annexin?Ⅴ?FITC染色30 min,用200目尼龙网过滤后上机检测，取4 000～10 000个细胞检测，再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例,并计算增殖指数（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）,每组设 3个样品。

　　1?3?4  p21WAF1、CDK4、野生型p53蛋白的检测                                   
　　应用Western blot检测方法，细胞经培养后（贴壁细胞应用0?5%胰酶消化）用冷的PBS洗3 次,加入600 μl RIPA 裂解液(2×106细胞) ,置冰上30 min后, 4 ℃ 15 000 r/min离心30 min,上清即为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?PAGE）,分离胶为10%;100 V 转膜,5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h后,置于兔抗人一抗(用封闭液1∶2 000稀释)中1 h,TBST 洗4次,每次10 min。置辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(用封闭液1∶5 000稀释)中1 h,TBST 洗4次,每次10 min，用DAB显色系统进行显色,并记录各蛋白与β?肌动蛋白（β?actin）光度比值（IA）,每组重复检测4次取平均值。

　　1?4　统计学处理                                   
　　SPSS13?0数据处理软件包进行数理统计，所有计量资料均采用x±s表示，首先进行方差分析，根据方差分析结果选择采用t或t′检验。

　　2 结果

　　2?1  NB4细胞生长曲线                                   
　　见图1。可以看到联合用药组细胞数量明显下降，到用药后的第7天中数量将至最低。

　　2?2  NB4细胞经各组处理后生长抑制率和PI                                   
　　见表1。可以看到与对照组比较，SPB组和吉非替尼处理过的细胞生长抑制率明显变大，PI明显下降；但是与单纯SPB组和吉非替尼组比较，联合用药组上述指标变化更加明显（P＜0?05)。表1 NB4细胞经各组处理后生长抑制率和PI(略)

　　2?3 NB4细胞中p53、p21WAF1、CDK蛋白的检测                                   
　　见表2，可以看出，联合用药组细胞的p53、p21WAF1、CDK蛋白均明显上升（P＜0?05)。表2  NB4细胞中p53、p21WAF1、CDK蛋白的检测(略)

　　2?4  流式细胞仪检测细胞的凋亡                                   
　　见图2。可以看出联合用药后NB4细胞凋亡锋增加，细胞凋亡率明显上升。
　　
　　3  讨论

　　组蛋白乙酰化/去乙酰化是调控基因表达的重要方式之一，目前认为组蛋白乙酰化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化可抑制基因表达〔2〕。很多肿瘤的染色体易位均涉及组蛋白去乙酰化酶活性异常，引起抑癌基因表达抑制或癌基因激活和过度表达从而导致肿瘤的发生。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAIS）是一类抗恶性肿瘤的化疗新药，体内和体外实验证实的其抗肿瘤作用机制包括以下几点〔3〕：(1)诱导肿瘤的分化效应；(2)通过影响p21WAF1、 p53、Rb、myc等与细胞周期相关的基因改变肿瘤细胞的周期变化；(3)诱导细胞的凋亡；(4)上调主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ、Ⅱ、CD40 分子从而起到免疫调节的作用；(5)抑制肿瘤血管的生成；(6)逆转已经转化的表型；(7)激活已经沉默的基因；(8)恢复耐药细胞对药物的敏感性。吉非替尼是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，该酶通常表达于上皮来源的实体瘤〔4〕。对于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨碍肿瘤的生长，转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。在体内，吉非替尼广泛抑制异种移植于裸鼠的人肿瘤细胞衍生系的肿瘤生长，并提高化疗、放疗及激素治疗的抗肿瘤活性。由于肿瘤本身是一种多因素、所步骤、多基因改变的疾病，每种药物均只能针对一种或几种靶分子起作用，如果将多种抑制剂联合应用可能会使药物发挥更好的效果，联合用药将成为医学肿瘤学的发展趋势。从以上对两种药物作用机制分析后，我们推断联合应用这两种药物可能通过以下途径起协同作用：(1)加强肿瘤细胞的周期抑制，使细胞阻滞在G1期；(2)抑制肿瘤周围血管生成和抑制肿瘤细胞的转移；(3)增强与肿瘤增殖、周期相关的蛋白如p21WAF1、 p53、CDK的表达。我们在检测了SPB和吉非替尼最佳用药浓度后进行了联合用药的实验，并对NB4细胞的生长、凋亡以及一些蛋白表达情况进行了观察。结果发现联合用药加强了对肿瘤细胞的生长抑制，细胞的增殖指数明显下降，同时对p21WAF1、p53、CDK这些与细胞增殖和周期相关蛋白有一定的影响。p53基因和蛋白是目前研究比较广泛的肿瘤抑制性因素, p21WAF1通过对cyclinD1?CDK4复合物强烈抑制,以协调细胞周期、DNA 复制与修复之间的关系〔5〕。目前所知p21WAF1的主要生理作用包括:①抑制CDK 活性; ②抑制细胞G1?S进程; ③直接或间接地抑制DNA 复制; ④协调细胞周期与DNA 修复;⑤可能在细胞终末分化和肿瘤细胞分化中起一定作用。CDK一般与cyclin结合成复合物发挥着与p21WAF1截然相反的作用。同时p53依赖的 DNA损伤途径可以激活p21WAF1的表达, 而p21WAF1的激活又会抑制cyclinD1?CDK4复合物的表达，依此它们之间形成网络调节关系，共同调节着肿瘤细胞的增殖或者凋亡。我们研究发现联合用药可以增加p53、p21WAF1的表达，降低CDK4的表达，通过这些结果分析，我们认为联合应用苯丁酸钠与吉非替尼可以增加NB4细胞的凋亡率，其机制是通过p53依赖的p21WAF1的激活进而抑制cyclinD1?CDK4复合物，从而阻滞了肿瘤细胞的增殖周期。

基金项目：吉林省计委资助项目（20031268）

【参考文献】
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　　2 孟玫,姜军梅,尹晓燕,等?苯丁酸钠对两种人肝癌细胞抑癌基因表达的影响〔J〕?中国药理学通报，2005;21(11):1406?7?

　　3 高静，栾信庸，许风雷，等?苯丁酸钠单用与氟尿嘧啶或顺铂联用对喉癌Hep?2细胞株的影响〔J〕?中国新药与临床杂志，2005;24（10）：778?80?

　　4 Jing L,Brahmer J，Messersmith W,et al?Binding of gefitinib, an inhibitor of epidermal growth factor receptor?tyrosine kinase, to plasma proteins and blood cells: in vitro and in cancer patients〔J〕?Invest New Drugs, 2006;24(4):291?7?

　　5Radhakrishnan SK,Gierut J,Gartel AL?Multiple alternate p21 transcripts are regulated by p53 in human cells〔J〕?Oncog，2006;25(12):1812?5?

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是否可以成为易瑞沙耐药后的另一方案，也许比易瑞沙+反应停更有效果。